КАК ИХ ДЕЛАЮТ
Для производства биологически активных пептидов могут применяться как химические, так биотехнологические методы.
Технология рекомбинантной ДНК, подразумевающая использование генетически модифицированных штаммов микроорганизмов, особенно хорошо подходит для синтеза крупных пептидов белков, но не ограничивается только ими.
Химический синтез - отличный выбор для производства малых и средних молекул, состоящих из 5-80 аминокислотных остатков: он прост, универсален и позволяет получить более чистые формы пептидов, не содержащие аллергенов и иных нежелательных примесей.
Этот метод удобен и для модификации пептидных молекул, позволяющей повысить их активность и стабильность. (К слову, в случае факторов роста (а это тоже пептиды, хотя они и остались за рамками статьи: эта тема заслуживает отдельного рассмотрения) можно вычислить способ синтеза по названию ингредиента в соответствии с международной номенклатурой:
приставка sh- означает синтетический, а rh- рекомбинантный, т. е. биотехнологический)
Ферментативный синтез практически не применяется для получения пептидов, содержащих более 10 аминокислотных звеньев – по сути, он в основном применяется для ди- и трипептидов (в частности, таким способом можно получать пептиды-матрикины, о которых речь пойдет ниже).
Химические и биотехнологические методы не взаимоисключающи:
в последнее время наблюдается тенденция к развитию технологий, сочетающих оба метода, хотя на сегодняшний день химический синтез все же преобладает, поэтому остановимся на этом способе несколько подробнее.
В теории все выглядит довольно просто:
аминокислота + аминокислота – вода = пептид.
На деле реакция не протекает самопроизвольно: ее нужно как-то подтолкнуть - например, с помощью специальных реагентов, которые образуют более активные интермедиаты и удаляют из системы воду.
Но для получения желаемого пептида этого мало: для получения заданной пептидной последовательности критичен порядок сборки цепи.
Например, при взаимодействии фенилаланина и валина возможно образование пептидов FF, VV, VF и FV (два последних отличаются только тем, какая из аминокислот прореагировала по карбоксилу, а какая по аминогруппе).
А ведь реакция может пойти и дальше, с образованием более длинных молекул.
Соответственно, для получения конкретного пептида нужно будет блокировать аминогруппу одной аминокислоты и карбоксильную группу - другой, чтобы порядок сборки цепочки был именно таким, как надо.
Для этого к ним присоединяются специальные защитные группы, которые впоследствии отщепляют, причем желательно, чтобы условия их отщепления были разными: это дает возможность контролируемо удлинять цепочку, повышая выход целево го продукта.
Поскольку, как уже упоминалось выше, молекула пептида имеет «направление» (С-конец и N-конец), и цепочка обычно наращивается со стороны аминогруппы, на протяжении всего процесса защищают именно терминальную карбоксильную группу.
Если же, как, к примеру, в случае лизина, в молекуле содержатся две реакционно способные аминогруппы, стратегия синтеза дополнительно осложняется необходимостью защиты либо обеих, либо одной из них.
Защитные группы «пришивают» к молекулам аминокислот перед тем, как ввести их в реакцию.
Таким образом, в общем виде процесс можно представить как повторяющийся цикл: образование пептидной связи: промывка – отщепление защитной – группы –промывка, и далее по кругу до получения нужного пептида и отщепления защиты С-конца молекулы с последующей очисткой конечного продукта.
Для улучшения проникновения в роговой слой пептиды часто векторизуют, «пришивая» (обычно к N-концу) дополнительную группу: чаще всего это ацетил (CH CO-), миристоил- (СН3(СН2)12CO-) или пальмитоил (CH3(CH2)14CO-), которые в аминокислотной последова тельности обозначаются соответственно приставками Ас Мут- и Pal-.
Сам синтез можно вести в твердой фазе либо в растворе.
Твердофазный пептидный синтез протекает в гелеобразуемом полимером, не растворяющимся, но набухающим в реакционной среде. Это достаточно быстрый способ, который можно автоматизировать.
Он позволяет получить любые количества пептидов, в том числе и очень маленькие (правда, с увеличением масштаба падает скорость и уменьшаются возможности для автоматизации), но очистка конечного продукта требует значительных усилий, а расход реагентов довольно высок (при небольшом расходе растворителей).
Синтез в растворе (жидкофазный) нуждается в тщательном планировании: если для твердофазного синтеза существует общий протокол, подходящий для большинства пептидов, то здесь такой опции нет. Жидкофазный синтез протекает медленнее, его намного сложнее автоматизировать (как и защитить боковые цепи аминокислот от нежелательных реакций: не все варианты при этом способе хорошо работают).
В принципе, он так же пригоден для получения любых количеств пептидов, но особенно подходит для крупномасштабного синтеза; расход реагентов при этом способе меньше, а очистить конечный продукт проще.
Даже такое весьма общее описание процесса дает представление о его сложности и позволяет понять, почему же пептиды стоят так дорого.
Однако очень высокая активность пептидов компенсирует их стоимость и позволяет эффективно использовать эти ингредиенты в самых разнообразных рецептурах в очень низких дозировках часто порядка тысячных и десятитысячных долей процента в пересчете на активный пептид.
Тем не менее по причине сложности и высокой стоимости синтеза очень многие сырьевые компании не производят пептиды сами, а заказывают их у тех, кто на этом специализируется.
Это может быть, например, Bachem AG со штаб-квартирой в Швейцарии и несколькими производственными площадками, расположенными в Европе, США и Японии, или канадская Bio Basic Inc.
Крупными поставщиками косме тических пептидов являются Корейский биотехнологический гигант Caregen, с которым соперничает (и доволь но успешно) ряд китайских производителей (Hangzhou Rebtech Novel Material Co., Zhejiang Peptides Biotech Co., Ningbo Gino Chemical Co.) и другие.
К слову, в ассортименте китайских производителей и поставщиков есть практически все пептиды, предлагаемые крупными европейски ми компаниями (DSM, Sederma, Lipotec и др.).
ПЕПТИДЫ В КОСМЕТИКЕ:
КАК ЭТО РАБОТАЕТ.
Пептиды способны активировать важные биологические функции, действуя как сигнальные молекулы, связываясь со специфическими рецепторами и регулируя работу ключевых генов и молекул.
В отличие от крупных белков, их легче вводить в рецептуру, они более активны на коже, лучше совместимы с системами доставки и глубже прони кают в эпидермис.
Изначально интерес к пептидам в косметике возник на фоне их практического применения в медицине для за живления ран.
Поскольку эти биорегуляторы участвуют в огромном количестве физиологических процессов, было вполне логично использовать их в косметических целях.
Большинство косметических пептидов предназначены для противодействия процессам, протекающим при старении.
Потребность в таких продуктах обусловлена растущим в современном обществе желанием сохранить красоту кожи и волос, увядающую с возрастом, а также огромным спектром возможных способов реализации этой задачи.
Пептиды в современной косметике это высокотехнологичные компоненты с солидной научной базой и доказанной эффективностью.
По способу действия их часто делят на три основные группы, хотя некоторые пептиды бывают настолько разноплановыми, что их сложно однозначно от нести к той или иной группе.
СИГНАЛЬНЫЕ ПЕПТИДЫ.
Стареющая кожа, помимо прочего, характеризуется пониженным содержанием коллагена и эластина.
Соответственно, увеличение количества активных фибро бластов, стимуляция выработки ими коллагена и/или ингибирование дальнейшего распада структурных белков считаются эффективными способами, позволяющими замедлить развитие возрастных изменений кожи.
Многие пептиды, используемые в косметических средствах, действуют на фибробласты.
Самые известные представители обширной группы сигнальных пептидов матрикины: небольшие пептидные фрагменты, образующиеся при ферментативном гидролизе структурных белков дермального матрикса.
Эти фрагменты подают сигнал фибробластам, запускающим синтез новых белков взамен разрушенных.
Этот механизм работает не только при повреждениях кожи, но и в ходе нормального обновления: ликвидация старых, изношенных структур подразумевает их воссоздание в обновленном виде.
С возрастом процессы обновления кожи, как и многие другие, протекают менее эффективно, и тогда на помощь приходит косметика с матрикинами.
1️⃣ Одним из примеров такого рода пептидов является гексапептид VGVAPG, аминокислотная последовательность которого представляет собой хемотаксический домен эластина: именно такая цепочка аминокислот несколько раз повторяется в молекуле тропоэластина.
Было обнаружено, что этот пептид стимулирует пролиферацию
фибробластов кожи человека.
В косметике применяется его векторизованное производное Pal-VGVAPG (INCI: Palmitoyl Hexapeptide-12): оно разглаживает кожу, повышает ее тонус и упругость.
2️⃣ Пентапептид KTTKS представляет собой субфрагмент пропептида коллагена I типа: это минимальная аминокислотная последовательность, стимулирующая биосинтез компонентов внеклеточного матрикса в фибробластах.
Он дозо- и времязависимым образом увеличивает выработку коллагена I и II типов и фибронектина, не оказывая влияния ни на общий синтез белков в клетках, ни на соотношение секретируемых и клеточно-ассоциированных белков. Векторизованная версия этого пентапептида Раl-КTTKS (INCI: Palmitoyl Pentapeptide-4) - ❗️тот самый знаменитый Matrixyl®, один из первых косметических пептидов, с которых и начался бум на пептидную косметику.
Однако одними лишь матрикинами группа сигнальных пептидов не исчерпывается.
Многие из них работают НЕ как прямые мессенджеры, а опосредованно.
Например, замедление деструкции внутриклеточного матрикса и связанного с этим старения кожи может реализоваться путём ингибирования матриксных металлопротеиназ, разрушающих коллаген и эластин.
3️⃣ В частности, гептапептид YYRADDA, известный также как Pro-collagen C peptide, воспроизводит аминокислотную последовательность в проколлагене I типа, которая расщепляется во время превращения проколлагена в коллаген.
Этот пептид ингибирует определенную специфическую протеиназу и тем самым уменьшает степень разрушения коллагена.
4️⃣ Трипептид Ela-KFK, конъюгированный с элаидиновой кислотой (INCI: Elaidyl Tripeptide), активирует TGF-B - фактор, способный увеличивать экспрессию коллагена, эластина и TIMP-1 (тканевого ингибитора металлопротеиназы-1).
5️⃣ Сходным образом действуют пептиды KVK и VGVVAPG, запускающие синтез коллагена посредством активации TGF-3.
Первый из них используется в косметике против морщин в векторизованной форме Pal-KVK (INCI: Palmitoyl Tripeptide-5), демонстрируя высокую эффективность.
6️⃣ Трифторацетилированный трипептид F3Ac-VYV (INCI: Trifluoroacetyl Tripeptide-2) снижает активность матриксной металлопротеиназы, отвечающей за деструкцию эластина, уменьшает выработку прогерина и стимулирует синтез протеогликанов. В результате его использования кожа становится более гладкой, морщины сокращаются.
Дряблость кожи (в том числе птоз), отражающая потерю эластичности, вызванную усиленной деструкцией и снижением выработки эластина в дерме отчетливый признак старения.
7️⃣ Ацетилированный тетрапептид Ас-KDVY (INCI: Acetyl Tetrapeptide-2) был специально разработан для противодействия птозу: он повышает активность фибулина-5 и LOXL1, стимулирует синтез эластина и, что очень важно, способствует правильному формированию пространственной сетки эластиновых волокон.
8️⃣ За правильную организацию белков внеклеточного матрикса отвечает и тетрапептид KDI-Cit (INCI: Tripeptide-10 Citrulline), воспроизводящий часть аминокислотной последовательности декорина протеогликана, влияющего на фибриллогенез; этот участок молекулы декорина связывается с коллагеновыми фибриллами.
Пептид обеспечивает регуляцию фибриллогенеза коллагена и ремоделирование организации его волокон, обеспечивая равномерный диаметр фибрилл и повышение эластичности кожи за счет лучшего сцепления коллагеновых волокон.
9️⃣ Векторизованный пептид Pal-KMO2K (INCI: Palmitoyl Tripeptide-38), созданный по мотивам трипептидного фрагмента КМК, обнаруженного в коллагене IV типа и ламининах, стимулирует синтез компонентов внеклеточного матрикса – гиалуроновой кислоты, коллагена I, III и IV ти пов, ламининов и фибронектина.
Это обусловливает сокращение морщин, в особенности в области лба и глаз.
1️⃣0️⃣ Прототипом для гексапептида SIKVAV (INCI: Hexapeptide-10), работающего в области базальной мембраны, послужил фрагмент а-цепи ламинина-1. Этот пептид стимулирует клеточную пролиферацию и синтез ламинина-5. Под его воздействием происходит уплотнение дермы, в результате чего существенно повышается упру гость и эластичность кожи.
1️⃣1️⃣ В векторизованном тетрапептиде Pal-GQPR (INCI: Palmitoyl Tetrapeptide-7/3) воспроизводится фрагмент аминокислотной последовательности белка IgG, регулирующего выработку интерлейкина-6 значимого провоспалительного фактора, приводящего к преждевременному старению кожи. Этот пептид способствует снижению как фоновой выработки, так и УФ-индуцированного выброса IL-6 в кератиноцитах и фибробластах, что приводит к по вышению упругости кожи in vivo.
В норме в нашем организме есть важный гормон, который помогает контролировать IL6 и индуцируемый им воспалительный процесс дегидроэпиандростерон (DHEA).
С возрастом выработка этого гормона угасает, и пептид в некоторой степени компенсирует недостаток DHEA, чем и объясняется его эффективность против признаков старения.
Один из самых явных признаков возраста старческие пигментные пятна. За запуск меланогенеза отвечает а-меланоцитстимулирующий гормон (a-MSH) - соединение пептидной природы, представляющее собой фрагмент проопиомеланокортина.
1️⃣2️⃣ Тетрапептид PKEK
(INCI: Tetrapeptide-30) снижает УФ-В-индуцированную экспрессию воспалительных хемокинов, способствующих развитию гиперпигментации, и уменьшает выработку проопиомеланокортикотропина кератиноцитами.
Исследования in vivo показали заметное осветление кожи и выравнивание ее тона под действием этого пептида.
1️⃣3️⃣ Ацетилированный тетрапептид AHSH (INCI: Acetyl Tetrapeptide-5) укрепляет сосуды и работает как ингибитор ангиотензинпревращающего фермента, помогая расслабить стенки капилляров и увеличить их просвет. Благодаря такому действию он способствует уменьшению отеков, особенно в области вокруг глаз, и темных кругов под глазами.
1️⃣4️⃣ С ходный эффект демонстрирует и дипептид VW (INCI: Dipeptide-2).
1️⃣5️⃣ Дипептид В-АН, известный как карнозин (INCI: Carnosine), помогает коже противостоять негативному воздействию УФ- и ИК-излучения, высокоэнергетического видимого света и загрязнения воздуха.
Он нейтрализует активные формы кислорода, связывает ионы поливалентных металлов, способных выступать в роли прооксидантов, и инактивирует высокореакционноспособные моно- и диальдегиды, образующиеся при окислительном распаде ненасыщенных липидов, тем самым защищая гидрофильные и липофильные биомолекулы от окислительного повреждения.
Карнозин ингибирует процессы не ферментативного гликозилирования белков, в результате которых образуются цитотоксичные конечные продукты, ухудшающие внешний вид кожи, а белки не просто утрачивают свой функционал, но и становятся недоступными для внутриклеточных систем детоксикации.
Он уменьшает выраженность морщин и восстанавливает тонус и эластичность кожи.
Однако, несмотря на широкий рабочий диапазон рН (4-9) и термостабильность (карнозин можно греть до 80°С), существует риск его ферментативного
гидролиза в коже, что не всегда желательно.
1️⃣6️⃣ Карцинин (INCI: Decarboxy Carnosine HCL) этого недостатка лишен, но обладает всеми основными преимуществами карнозина (а в чем-то и превосходит его). Он не только стимулирует метаболизм, защищает от окислительного стресса и неферментативного гликозилирования, но и обращает гликозилирование вспять и выводит гликотоксины.
Не стоит забывать, что старение отражается не только на коже, но и на волосах, включая брови и ресницы.
И пептидной косметике есть чем ответить на этот вызов.
Например, векторизованный пентапептид Муг-КLАKK-NH2 (INCI: Myristoyl Pentapeptide-17) стимулирует экспрессию генов, отвечающих за выработку кератина в волосяных фолликулах, и предназначен прежде всего для стимуляции роста ресниц: этот пептид всего за две недели способен сделать ресницы заметно толще и длиннее.
Сходный эффект дает и векторизованный гексапептид Myr-LKKTQT (INCI: Myristoyl Нехареptide-16), который дополнительно обладает противовоспалительной активностью.
Векторизованный тетрапептид, в молекуле которого воспроизводится аминокислотная последовательность активного участка a-MSH (INCI: Palmitoyl Tetrapeptide-20), стимулирует синтез меланина и перенос меланина в кератиноциты, повышает активность каталазы и уменьшает избыточную выработку пероксида водорода, благодаря чему способствует постепенному восстановлению натурального цвета седых волос и замедляет поседение.